高效液相色谱以其灵敏、高效快捷、液相可分离大多数液体样品等优点,色谱沙参广泛应用于中药有效成分含量测定、法测组分分析、定北指纹图谱等方面。中的蔗糖指纹紫外检测器(UV)具有高灵敏度和稳定性,图谱因此高效液相色谱中应用较为广泛,高效但是液相对于没有紫外吸收或紫外末端吸收的有机化合物,其无法检测。色谱沙参蒸发光散射检测器(ELSD)弥补了上述紫外检测器的法测不足,显示出极大的定北优越性。2020年版《中国药典》已经在黄芪、中的蔗糖指纹四季青、图谱酸枣仁、高效山银花等20种中药材的含量测定项目中使用蒸发光散射检测器。
北沙参是伞形科植物珊瑚菜(GlehnialittoralisFr.SchmidtexMiq.)的干燥根,为常用中药,可缓解口燥咽干、肺热咳嗽等病症,其主要化学成分为糖类、香豆素类、磷脂、生物碱、氨基酸、挥发油、微量元素等。有研究表明,北沙参中的糖类成分含量最高,具有较好的抗肿瘤、抗氧化以及免疫调节活性。因此对北沙参中糖类成分进行测定,可以有效评价北沙参的质量,保证临床用药有效性。中药指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴定手段,可从整体上鉴别评价中药材及中药制剂半成品质量的真实性、优良性、稳定性。成分测定与指纹图谱联合使用,可以全面评价中药的质量。
目前法定标准中没有北沙参的含量测定和指纹图谱检测项目,为了增强标准的可控性,笔者建立了北沙参的指纹图谱测定方法和蔗糖的含量测定方法,以期为制订北沙参质量标准奠定基础。
高效液相色谱仪:Waters2695型,附带Waters2420型蒸发光散射检测器和Empower色谱工作站,美国waters公司。精密电子天平:AGBP210S型,感量为0.00001mg,德国Sartorius公司。乙腈:色谱纯,美国赛默飞世尔公司。实验所用其余试剂均为分析纯。实验用水为超纯水。蔗糖对照品:50mg,编号为1507–200001,中国药品生物制品检定研究院。
北沙参药材编号和来源见表1。
取蔗糖对照品10mg,精密称定,加水定容至10mL的量瓶中,配制成1mg/mL的蔗糖对照品溶液,摇匀,用0.45µm微孔滤膜滤过,即得。
取北沙参样品粉末(过0.42mm筛)4g,精密称定,加40%乙醇240mL,超声提取(功率250W,频率53kHz)30min,滤过,取续滤液100mL,浓缩至10mL,0.45µm微孔滤膜滤过,即得。
谱柱:InnovalNH2色谱柱(250mm×4.6mm,5µm,北京艾杰尔科技有限公司);流动相:乙腈-水(80∶20),等度洗脱;流量:1mL/min;柱温:30℃;ELSD的漂移管温度:60℃;喷雾器加热级别:100%;气体压力:137.90kPa。
蒸发光散射检测器的系统条件由喷雾器加热级别、漂移管温度、气体压力和增益4个条件组成,由于增益值仅影响信号放大的程度,对检测结果没有影响,所以本试验以漂移管温度A、喷雾器加热级别B、气体压力C为3个考察因素,每个因素分别设有三个水平,通过正交试验对检测器条件进行优选,因素水平见表2。
精密吸取对照品溶液10µL,注入高效液相色谱仪进行检测。以蔗糖的峰面积作为评价指标,优选条件。结果见表3~表5。
由表5可知,A、C两个因素P值均小于0.05,说明漂移管温度、气体压力这两个因素对蔗糖的测定均具有显著性意义;B因素的P值大于0.05,说明喷雾器加热级别对蔗糖的测定不具有显著性意义。根据试验结果进行直观分析,A1B3C1为最佳选择,即漂移管温度为60℃,喷雾器加热级别为100%,气体压力为137.90kPa。
氨基柱其固定相是以超纯全多孔球形硅胶为基质,通过采用独有的固定相键合技术,使用含有氨基丙基官能团的有机硅烷键合而成,能比硅胶柱更快达到平衡,对流动相的水含量没有硅胶柱敏感。氨基柱可用于极性化合物的正相分析,弱阴离子交换以及含水的反相液相分析。氨基柱柱被广泛应用于木糖、乳糖、葡萄糖等糖类的反相分析模式中。故本实验选用氨基柱作为色谱柱。
实验选用氨基柱作为色谱柱。分别吸取蔗糖对照品溶液和样品溶液各10µL,注入高效液相色谱仪检测,开启ELSD采集信号,得到蔗糖对照品和样品的蒸发光检测色谱图,见图1、图2。由图1、图2可知,对照品图谱和样品图谱中,ELSD检测到蔗糖峰在11.5min附近。
取蔗糖对照品溶液,分别进样2.5、5、10、15、20、25µL,经ELSD检测,以蔗糖进样质量的自然对数值为横坐标X,以蔗糖峰面积的自然对数值为纵坐标Y,进行线性回归计算得线性回归方程为Y=1.1180X+11.86(r=0.9997),结果表明,蔗糖进样质量在7.30~72.95µg范围内线性关系良好。将蔗糖对照品溶液逐级稀释,分别进样分析,以3倍信噪比计算检出限,计算得检出限为0.02mg/mL。
相关链接:乙腈,蔗糖,木糖,氨基酸
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